Laporan Praktikum Biokimia

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

Rara Santi Yonatha Thresia 

I. Nama Percobaan              :  Penentuan Kadar Tirosina Dalam Kaseina

II. Hari/Tanggal                    :  Jum’at/ 27 Juni 2011

III. Tujuan Percobaan         : Menentukan kadar tirosin dalam kasein serta dapat membuat kurva kalibrasinya.

IV. Landasan Teori              :

Protein merupakan komponen utama dalam semua sel hidup. Fungsinya terutama ialah sebagai unsur pembentuk struktur sel, misalnya dalam rambut, wol, kolagen, jaringan penguhubung , membran sel, dan lain-lain. Selain itu dapat pula berfungsi sebagai katalis proses biokimia dalam sel. Protein aktif selain enzim, yaitu hormon, pebawa O₂ (hemoglobin). Protein yang terikat pada gen, toksin, antibody/antigen, dan lain-lain. Protein dapat diklasifikasikan atas dasar beberapa kriteria, misalnya berdasarkan fungsinya, kelarutan, konformasi dan sebagainya

Salah satu fungsi protein adalah sebagai protein cadangan (makanan/nutrien). Protein cadangan disimpan untuk berbagai proses metabolisme dalam tubuh. Sebagai contoh misalnya : ovalbumin, merupakan protein yang terdapat pada putih telur; kasein , merupakan protein susu; feritin merupakan tempat cadangan besi dalam limpa; zein merupakan protein dalam biji jagung.  Kasein merupakan protein nutrien dan penyimpan, dan merupakan protein yang paling utama dalam susu, yang jumlahnya kira-kira 80 % dari total protein yang ada dalam susu. Protein susu terbagi menjadi dua kelompok utama, yaitu kasein yang dapat diendapkan oleh asam dan renin dan protein whey yang dapat mengalami denaturasi oleh panas pada suhu kira-kira 65^o C. Kasein terdapat dalam bentuk kasein kalsium, senyawa kompleks dari kalsium fosfat dan terdapat dalam bentuk partikel-partikel kompleks koloid yang disebut Micelles.

Dalam kasein terdapat asam amino yaitu Tyrosin (Tyr).  Tyrosin merupakan salah satu dari tujuh asam amino yang mempunyai gugus -R polar tetapi tidak bermuatan. Gugus R dari asam amino polar lebih larut di dalam air atau lebih hidrofilik dibandingkan asam amino non polar, karena golongan ini mengandung gugus fungsional yang membentuk ikatan hidrogen dengan air. Polaritas tyrosin disebabkan oleh gugus hidroksil yang terdapat didalamnya..

          Protein juga memiliki molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000 sampai jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim, protein akan menghasilkan asam-asam amino. Ada 20 jenis asam amino yang terdapat dalam molekul protein. Asam-asam amino ini terikat satu dengan yang lainnya oleh ikatan peptida. Protein mempunyai sifat yang sangat dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH, dan pelarut organik.

          Jenis asam amino yang kita gunakan adalah Tirosin dengan rumus :

Tirosin adalah salah satu jenis asam amino dalam protein. Tirosin ini mempunyai gugus fenol dan bersifat asam lemah. Tirosin dapat diperoleh dari kasein, yaitu protein dalam keju atau susu.

          Pada percobaan ini kita akan melakukan pemurnian tirosin dari kaseinnya dengan melarutkan tirosin ke dalam berbagai larutan yang bersifat asam, alkohol, maupun senyawa yang mengandung logam berat. Dengan demikian, kita harus memperhatikan sifat-sifat protein antara lain :

1.      ionisasi

seperti asam amino, protein juga larut dalam air akan membentuk ion yang mempunyai muatan positif dan negatif. Dalam suasana asam molekul protein akan membentuk ion positif, sedangkan dalam suasana basa akan membentuk ion negatif. Pada titik isolistriknya protein mempunyai muatan positif dan negatif yang sama, sehingga tidak bergerak kearah elektroda positif maupun negatif apabila ditempatkan diantara kedua elektrode tersebut. Ionisasi protein dapat digambarkan sebagai berikut

protein⁺                               H⁺   +  ⁺protein^-

kation                                                  ion zwitter

protein memiliki titik isolistrik yang berbeda-beda sebagaimana yang tertera dalam tabel berikut :

Tabel Titik Isolistrik Berbagai Protein :

Protein	Sumber	pH isolistrik
Albumin telur	Telur	4,55 – 4,90
Insulin	Pancreas	5,3 – 5,35
Albumin serum	Darah	4,88
Kasein	Susu sapi	4,6
Gelatin	Kulit sapi	4,8 – 4,85
Globulin serum	Darah	5,4 – 5,5
Fibroin	Sutera	2,0 – 2,4
Gliadin	Terigu	6,5

           

Titik isolistrik protein mempunyai arti penting karena pada umunya sifat fisika, dan kimia erat hubungannya dengan pH isolistrik. Pada pH diatas titik isolistrik protein bermuatan positif, sedangkan di bawah titik isolistrik protein bermuatan negatif.

          Oleh karena itu untuk mengendapkan protein dengan ion logam, diperlukan pH larutan diatas titik isolistrik, sedangkan pengendapan oleh ion negatif memerlukan pH dibawah titik isolistrik. Ion-ion posisitf yang mengendapkan protein antara lain ialah Ag⁺, Ca⁺⁺, Zn⁺⁺, Hg⁺⁺, Fe⁺⁺, CU⁺⁺, dan Pb⁺⁺, sedangkan ion negatif yang dapat mengendapkan protein adalah ion salisilat, triklorasetat, pikrat, tanat dan sulfosalisilat. Berdasarkan sifat tersebut putih telur atau susu dapat digunakan sebagai antidotum atau penawar racun apabila orang keracunan logam berat.

2.      Denaturasi

Protein akan mengalami koalgulasi apabila dipanaskan pada suhu 50^oC  atau lebih. Koagulasi ini hanya terjadi apabila larutan protein berada pada titik isolistriknya. Protein yang  terdenaturasi pada titik isolistriknya masih dapat larut pada pH di luar titik isolistrik tersebut. Air ternyata diperlukan untuk proses denaturasi oleh panas. Disamping pH, susu tinggi dan ion logam berat, denaturasi dapat pula terjadi oleh adanya gerakan mekanik, alkohol aseton, eter dan detergen.

Denaturasi suatu protein adalah hilangnya sifat-sifat struktur lebih tinggi oleh terkacaunya ikatan hidrogen dan gaya-gaya sekunder lain yang mengutuhkan molekul itu. Akibat suatu denaturasi adalah hilangnya banyak sifat biologis protein itu. Salah satu faktor yang menyebabkan denaturasi suatu protein ialah perubahan temperatur. Memasak putih telur merupakan contoh denaturasi yang tak reversibel. Suatu putih telur adalah cairan tak berwarna yang mengandung albumin, yakni protein globular yang larut. Pemanasan putih telur akan mengakibatkan albumin itu membuka lipatan dan mengendap; dihasilkan suatu zat padat putih.

 Perubahan pH juga dapat menyebabkan denaturasi. Bila susu menjadi asam, perubahan pH yang disebabkan oleh pembentukan asam laktat akan menyebabkan penggumpalan susu (curdling), atau pengendapan protein yang semula larut. Faktor-faktor lain yang dapat menyebabkan denaturasi adalah detergen, radiasi, zat pengoksidasi atau pereduksi (yang dapat mengubah hubungan S – S), dan perubahan tipe pelarut.

Beberapa protein (kulit dan dinding-dalam saluran pencernaan, misalnya) sangat tahan terhadap denaturasi, sedangkan protein-protein lain sangat peka. Denaturasi dapat bersifat reversibel jika suatu protein hanya dikenai kondisi denaturasi yang lembut, seperti sedikit perubahan pH. Jika protein ini dikembalikan ke lingkungan alamnya, protein ini dapat memperoleh kembali struktur lebih tingginya yang alamiah dalam suatu proses yang disebut renaturasi. Sayang denaturasi umumnya sangat lambat atau tidak terjadi sama sekali. Salah satu permasalahan dalam penelitian protein ialah bagaimana mempelajari protein tanpa merusakkan struktur lebih tingginya (struktur protein tersebut).

3.      Viskositas

Viskositas adalah tahanan yang timbul karena adanya gesekan antara molekul-molekul di dalam zat cair yang mengalir. Suatu larutan protein dalam air mempunyai viskositas atau kekentalan yang relatif besar daripada viskositas air sebagai pelarutnya.

4.      Kristalisasi

Banyak protein yang telah diperoleh dalam bentuk kristal. Meskipun demikian proses kristalisasi untuk berbagai jenis protein tidak selalu sama, artinya ada yang dengan mudah dapat terkristalisasi, tetapi ada pula yang sukar.

5.      Sistem Koloid

Molekul protein apabila dilarutkan dalam air mempunyai sifat koloid, yang tidak dapat menembus membran atau kertas perkamen.

Pemurnian Protein

            Langkah awal yang dalam pemurnian protein ini ialah menentukan bahan alam yang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang terkandung didalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar protein tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan alam tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang akan dimurnikan. Setelah itu protein akan dilarutkan ke dalam air atau pelarut lainnya. Namun, disini juga harus diperhatikan susu dan pH larutan agar tidak merusak protein.

            Dalam percobaan ini untuk menentukan kadar atau konsentrasi protein ini kita menggunakan spektrometer yang berfungsi untuk menentukan transmittan maupun adsorbannya.

V. Alat dan Bahan

v     Alat :

-          Tabung reaksi

-          Beker gelas

-          Spektrometer

-          Erlenmeyer

-          Refluks kondensor

-          Penangas air

-          Statif dan klem

-          Pipet tetes

·        Bahan :

-          Kasein 1 gram

-          NaOH 6 N

-          H₂SO₄ 7 N

-          Larutan Tirosina standard 1.0 mg/ ml

-          HgSO₄ (5%) dalam H₂SO₄ 5 N

-          NaNO₂ (0,2%)

-          12 ml air

VI. Prosedur Percobaan

Hidrolisa 1,0 gram kaseina dengan 20, 0 ml NaOH 6 N pada refluks kondensor dalam penangas air selama 4 jam. Tambahkan hati-hati 30 ml H₂SO₄ 7 N. campur. Tempatkan 1,0 ml hidrolisat ke dalam tabung yang bersih dan kering. Pada tabung-tabung lain pipet masing-masing 1,0 ml larutan tirosina standar dengan lima macam kadar yang berbeda. Tambahkan 3 ml HgSO₄ 5 % dalam H₂SO₄ 5 N pada semua tabung. Panaskan dalam penangas air yang mendidih selama 10 menit. Dinginkan dan tambahkan ke dalam masing-masing tabung 2 ml H₂SO₄ 7 N dan 2 ml NaNO₂ 0,2 %. Campur dan tambahkan 12 ml air ke dalam masing-masing tabung. Baca ekstingsinya pada spektrometer dengan _maks = 470 nm.

VII. Hasil Pengamatan

No	[ ]	A	C	T	F
1	Aquadest	0	0	100%	1
2	Kasein	0,146	0,146	71,4%	1
3	Tirosin 1 mg/ml	0,603	0,603	2,5%	1
4	Tirosin 2 mg/ml	1,511	1,511	3,1%	1
5	Tirosin 3 mg/ml	2,225	2,225	0,6%	1
6	Tirosin 4 mg/ml	>3,379	>3,379	0,1%	1
7	Tirosin 5 mg/ml	>3,174	>3,174	0%	1

VIII. Reaksi Kimia

  

X. Pembahasan

          Pada percobaan kali ini tentang Penentuan Kadar Tirosin dalam Kasein. Tirosin yang  didapat dari susu, yang akan ditentukan kadar tirosinnya ini adalalah kasein. Kasein yang dijadikan sampel pada percobaan ini adalah kasein yang dibuat pada percobaan pembuatan kasein pada minggu sebelumnya dari susu dancow.

Kasein merupakan protein yang terkandung dalam susu. Protein terdiri dari asam amino. Asam amino yang terdapat dalam kasein ini adalah asam amino tirosin. Asam amino tirosin ini merupakan asam amino yang tergolong ke dalam asam amino gugus R polar tidak bermuatan.

Pada percobaan ini digunakan 1 gram kasein. Kasein ini kemudian direfluks  kondensor dalam penangas air dengan penambahan larutan NaOH selama 4 jam, tapi disini kami melakukan selama 3jam, setelah itu ditambahkan sedikit demi sedikit asam sulfat untuk menghidrolisa kasein tersebut sehingga dibebaskan asam amino tyrosin yang terkandung di dalam kasein tersebut. Saat kasein dihidrolisa dengan NaOH, kasein akan tercampur dan terikat secara sempurna dalam suhu yang stabil sehingga larutan bersifat basa. Dan ketika larutan ditambahkan dengan asam sulfat, maka akan terjadi pengikatan asam oleh basa dalam larutan kasein itu.

Kemudian kandungan alkohol yang terdapat dalam larutan ini akan dilepaskan sehingga akan menimbulkan warna. Warna larutan yang ditimbulkan dari hasil refluks ini adalah cokelat. Setelah itu larutan tyrosin ini ditambahkan dengan 3 ml HgSO₄ 5 % dalam H₂SO₄ 5 N dipanaskan selama 10 menit menghasilkan larutan bening, didinginkan dan ditambahkan larutan H₂SO₄ 7 N dan larutan NaNO₂ 0,2 % larutan menjadi warna coklat kemerahan. Penambahan larutan-larutan ini bertujuan untuk membentuk kompleks berwarna.  Dimana semakin besar konsentrasinya maka warnanya semakin pekat.

Selain itu juga dalam percobaan ini digunakan larutan standar sebagai pengkalibrasi dan juga sebagai acuan dalam menentukan kadar minimum suatu analit yang masih bisa dideteksi oleh spektrometer (limit deteksi). Dari hasil pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 470 nm  diperoleh harga absorbansi yang sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam tabung. Di mana semakin tinggi konsentrasi larutan, maka harga absorbansinya semakin besar. Dan juga dapat kita ketahui bahwa dari kelima tabung yang diuji, semakin besar konsentrasi larutan tyrosin, maka warna yang ditimbulkan dari reaksi kompleks semakin pekat sesuai dengan semakin besarnya kuantitas analit yang ada dalam larutan.

Ada beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam penentuan kadar zat dengan menggunakan spektrofotometer yang digunakan dalam percobaan ini, yaitu : analit harus memiliki gugus yang dapat menggeser serapan cahaya ke arah daerah tampak, dan juga sampel yang digunakan harus memiliki warna monokromatis (atau bersifat monokromatik). Jika sampel tidak berwarna, maka harus direaksikan dengan senyawa lain agar membentuk suatu senyawa kompleks yang berwarna (seperti yang kita lakukan pada percobaan ini).

Pada pengukuran dengan spektrofotometer, analit diletakkan di dalam kuvet untuk menghindari pengaruh luar dimana kuvet yang digunakan berupa sel kaca yang permukaannya halus (bersih) dan permukaan yang kasar. Sedangkan yang digunakan untuk meneruskan energi cahaya dalam daerah tampak adalah kuvet yang halus (bersih) agar dapat meneruskan. Dan permukaan yang kasar tidak digunakan untuk meneruskan cahaya.

XI. Kesimpulan

1. Tirosin merupakan salah satu asam amino yang terdapat dalam protein yaitu kasein yang utama terdapat dalam susu. Tirosin ini memiliki gugus Fenol dan bersifat asam lemah.
2. Alat spektrofotometer ini menggunakan cahaya UV-Vis yang menggunakan warna dalam penganalisisannya.
3. Semakin besar konsentrasi larutan asam amino maka semakin besar pula nilai adsorbannya
4. Kasein dihidrolisa dengan NaOH, kasein akan tercampur dan terikat secara sempurna dalam suhu yang stabil sehingga larutan bersifat basa.
5. Dengan penambahan basa pada asam amino menyebabkan konsentrasi OH^- mengikat ion-ion H⁺yang terdapat pada gugus –NH₃⁺.
6. Ditambahkan NaNO₂ pada larutan tirosin untuk memberikan warna merah pada larutan protein standar.